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　　克隆位點(diǎn)選擇的問題。首先要對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)掃描分析，列出其所含酶切位點(diǎn)清單。然后對(duì)照質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，所選擇的克隆位點(diǎn)必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點(diǎn)。雙酶切時(shí)盡量選擇酶切溫度相同，buffer一致，雙酶切效率高的兩個(gè)內(nèi)切酶，二者最好是您實(shí)驗(yàn)室常用的酶。保護(hù)堿基數(shù)目的問題。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入酶切位點(diǎn)后，常常要加入保護(hù)堿基，這是大家所熟知的。但保護(hù)堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視可能會(huì)大大影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展?？梢詤⒖汲Ｓ妹盖形稽c(diǎn)保護(hù)堿基，選擇酶切時(shí)間短且酶切效率高的堿基。

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